■周慕萍 黑龙江完达山哈尔滨乳品有限公司密山分公司
乳品掺假现象的发生已经对消费者的健康与安全形成危害，造成公共卫生问题。本研究通过免疫学检测羊乳中掺入牛乳含量的研究，优化了间接ELISA的检测条件：包被脱脂牛乳、牛乳酪蛋白以及灭菌乳稀释倍数1：128，l：32，1：128：分别加入经抗体修饰技术处理后的抗体，稀释度分别为：l：160，1：80，1：160，建立了检测羊乳样品中掺入牛乳成分含量的间接ELISA方法。
一、引言
牛乳与羊乳构成世界乳品市场的主要部分。羊乳及其制品由于营养丰富，更易于胃部吸收，风味独特，受到中外客商高端消费者的欢迎。但是，相对于奶牛，奶山羊生长缓慢，泌乳期短，冬季羊乳更是点滴无收。这导致羊乳产量非常有限，也给羊乳制品企业的原料采购造成巨大困难。羊乳因为受到季节波动性等影响价格偏贵。由于市场价格成本及原料控制及生产的诸多原因，便有不法分子在经济考量下昧着商业道德将牛乳掺入羊乳中鱼目混珠来降低成本，侵害消费者权益，违反商品标签法、消费者保护法及公平交易法。另一方面，也可能导致对牛乳过敏者在不知的情况下误食，而发生过敏反应，危害消费者健康与安全，造成公共卫生问题。
1.研究目的和意义
我国的乳品工业发展很快，原料基地分散、养殖规模小、且很不稳定，养殖从业人员的业务素质及职业道德有待提高。此外，由于利益的驱动，原料乳掺杂使假现象非常严重，从单纯的兑水、加入水解植物蛋白和淀粉类物质或增稠剂转向多重掺假，掺假技术不断“高明”，足能以假乱真。原料乳中掺入杂质，不仅会使牛乳和相应品质量降低，而且会给生产过程带来很大的困难，造成较大的经济损失，甚至会酿成重大的生产事故；因食奶粉中毒事件时有发生，直接危害到消费者的健康和婴幼儿的生命安全。另一方面，由于羊乳生产乳源产量小、高度分散的特殊性，使得生产企业生产纯的羊乳粉从源头陷入难以控制的困境，这是由于传统针对牛乳原料掺假及品质检验的方法与设备不适应于羊乳检验，况且羊乳中掺入一定量的牛乳从感官及传统常规指标上都难以检出，现场使用高精尖仪器设备（色谱仪，毛细管电泳仪等）也不可能，从生产企业保证生产到保护消费者的利益各个方面考虑都急需相应的检测方法。目前，针对牛乳中的源物质（如淀粉，糊精，脂肪，明胶粉，糖，水等）掺假检验国内外报道很多，也有许多成熟方法，开发了相应的设备仪器，但是对羊乳及其制品（乳酪等）中掺入牛乳成分等乳源性的检验国内很少报道，这与传统掺假检验和一般成熟的品质量分析是截然不同的新问题，很值得研究。
2.羊乳与牛乳的营养组成及生产现状
羊乳的总营养价值高于牛乳，其中干物质营养含量一般比牛乳高10％左右，羊乳中除乳糖外，蛋白质、脂肪、固形物等含量均高于牛乳。羊乳中维生素A、硫胺素、核黄素、尼克酸、泛酸、维生素B6、叶酸、生物素、维生素B12和维生素C等10种主要维生素的总含量比牛乳高；特别是维生素C的含量是牛奶的10倍；尼克酸含量是牛奶的2.5倍；维生素D的含量也比牛乳高。山羊乳含有多种矿物质，其含量远高于人乳，也高于牛乳。特别是钙和磷，不仅含量高，而且比例适当，对老人、青少年、婴幼儿、孕妇和哺乳期的妇女特别重要。羊乳pH7.0左右，具有抗变态反应的特性。而牛乳略偏酸性，pH6.6 ～ 6.8。所以对于胃酸分泌过多的人及胃溃疡患者，羊乳是一种有治疗作用的饮品。羊乳含脂量高，每100mL羊乳中含脂肪为4g。羊乳脂肪以脂肪球的形式或存在于乳中，脂肪球小而均匀，直径为2微米左右，丰富的中链脂肪酸不会造成脂肪的堆积，溶解快，食后在肠胃中保持液态，而牛乳的脂肪球在3--4微米左右。与牛乳相比，羊乳中的短链脂肪酸（C4 ～ C12）的含量稍高，其中C10的含量高许多。
二、方法
为建立间接ELISA检测乳品掺假，需要先对间接ELISA检测条件进行优化。根据优化条件建立检测方法，并且对检测方法做方法学鉴定。
1.间接ELISA方法的建立
间接ELISA法是先将待测抗原固相化，然后加入抗体，最后利用酶标记的抗抗体（酶标二抗）反应显示结果。
主要的实验部分：①包被：用0.05M pH 9.6包被缓冲液将待测样品适当稀释包被酶标板，100μl/孔，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBST洗板3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）。②封闭：每孔加入100μl 0.1％明胶在37℃下，温育1h，洗涤。③加抗体：加一定稀释的抗体100μl/孔，置37℃孵育2h。然后洗涤。（同时做空白孔、阴性对照）。④加酶标抗体：加100μl/孔体积比为1：1000稀释的酶标羊抗兔培IgG，37℃孵育1h，洗涤5次；⑤加底物显色：加入临时配制的底物缓冲液（TMB+H202）100pt/孔，室温下避光孵育15--20分钟。⑥终止反应：用浓度为2mol/L的[来自www.lW5U.coM]硫酸终止反应，50μl/孔；⑦检测：用酶联免疫测定仪，以空白孔为对照，波长为450nm时各孔吸收A值。间接ELISA法的建立，应对包被抗原的浓度、抗体以及酶标抗体的浓度进行实验确定，以达到最佳测定条件。实验中研究的包被抗原有两种，一是牛β-酪蛋白（作为后续检测方法的基础），另一种[来自Www.lw5U.com]以羊乳为基质添加不同量的牛乳（其中的检测目标物质也是牛β-酪蛋白）。
2.间接ELISA检测牛β-酪蛋白的结果
利用先前制备的血清抗体可以特异地检测牛乳β-酪蛋白，以有效地针对乳中掺入其他杂蛋白的掺假检测。
3.脱脂羊乳掺假检测的间接ELISA建立
将脱脂牛乳按梯度0、2、5、10、20、30、40、50、70、100％（v/v）掺入脱脂羊乳中作为待检样品。样品的最佳包被浓度为1：128，blockedanti-BC稀释度为1：80，酶标二抗稀释度为1：1000，建立间接ELISA试验。各个浓度的标准样都设立三个平行孔，求出它们吸光值的均值。
三、结论
本章建立了牛β-酪蛋白的间接ELISA测定方法以及羊乳中掺入牛乳检验的间接ELISA方法。两种方法都是针对牛乳中的β-酪蛋白为检测目标，检测目的以及建立ELISA所需要的抗原，抗体是不同的。前者是以β-酪蛋白为包被抗原，利用制备的兔抗牛β-酪蛋白血清抗体（anti-BC）建立间接ELISA方法。牛β-酪蛋白检测的线性范围是25-2500ng/mL，变异系数（CV）小于5％，回收率在93.5％ --127％；检测牛β-酪蛋白方法的重复性和准确度能满足检测要求，并且方便易行，可以通过β-酪蛋白与牛乳中总蛋白质的关系，用于牛乳及其产品的牛乳源性蛋白质的快速免疫方法检测，作为质量控制的重要指标。
四、展望
国际乳品行业普遍认为，羊乳中加入牛乳是一种掺假行为。本研究应实际检测需要，结合国内外先进的抗体制备及特异性检测方法，将特异性抗体运用于灵敏可靠的免疫学（ELISA）检测中，建立了间接ELISA快速检测方法，初步鉴定了其可靠性和特异性，灵敏度也不低于国内外同类方法，对羊乳乳品中掺入牛乳成分提供了新的检测途径，为乳品质量提供保障。
参考文献：
[1]羊奶制品为何掀不起大浪.消费日报，2006-5-15.
[2]芳文.羊乳异军突起，欲分羹乳品市场【J】.液态食品专题，2005，10（10）：26-28.
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